細(xì)菌RNA提取試劑盒（DNase I）說(shuō)明書(shū)
RNApure Bacteria Kit（DNase I）
細(xì)菌RNA提取試劑盒（DNase I）
Cat. No. K0539
保存：DNase I、10×Reaction Buffer：-20℃
其它組分：室 溫
組分說(shuō)明
Cat. No. k0539
Kit Size 50
DNase I 1000 U
10×Reaction Buffer 1000 μl
Buffer RL 35 ml
Buffer RW1 40 ml
Buffer RW2（concentrate） 11 ml
RNase-Free Water 10 ml
Shredder Spin column 50
Spin Column RM 50
Collection Tube（1.5 ml） 50
Collection Tube（2 ml） 100
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
本試劑盒采用高效、專(zhuān)一結(jié)合核酸的離心吸附柱和*的緩沖系統(tǒng)，可從細(xì)菌或培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞中快速提取總 RNA。30-40 分鐘內(nèi)即可完成反應(yīng)，提取的總 RNA 純度*，沒(méi)有蛋白質(zhì)和其他污染，適用于 RT-PCR、Real-Time RT-PCR、芯片分析、體外翻譯等實(shí)驗(yàn)。
注意事項(xiàng)
1. 預(yù)防RNase污染，應(yīng)注意以下幾方面：
1）使用無(wú)RNase的塑料制品和槍頭，避免交叉污染。
2）玻璃器皿應(yīng)在使用前于180℃高溫下干烤4小時(shí)，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分鐘，用水*沖洗后高壓滅菌。
3）配制溶液應(yīng)使用無(wú)RNase的水。
4）操作人員戴一次性口罩和手套，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要勤換手套。
2. Buffer RL 在使用前請(qǐng)加入β-巰基乙醇至終濃度為 1%，如 1 ml Buffer RL 加 10 μl β-巰基乙醇。加入β-巰基乙醇的
Buffer RL 4℃可保存 1 個(gè)月，如出現(xiàn)沉淀，請(qǐng)加熱溶解后使用。
3. 第一次使用前應(yīng)按照試劑瓶標(biāo)簽的說(shuō)明先在 Buffer RW2 中加入無(wú)水乙醇。
5. 如未特殊說(shuō)明，所有離心步驟均在室溫下進(jìn)行，且所有操作步驟動(dòng)作要迅速。
自備試劑：Lysozyme（YJ0887）、β-巰基乙醇、無(wú)水乙醇（新開(kāi)封或提取RNA專(zhuān)用）
操作步驟
1. 4℃ 10,000 rpm（~13,400×g）離心2分鐘收集菌體（菌體量最大不超過(guò)1×109 ），小心去除所有上清。
注意：上清如果有殘留，會(huì)影響后續(xù)的消化過(guò)程。
2. 用含有Lysozyme的100 μl TE緩沖液*重懸菌體，室溫孵育。具體配方和孵育時(shí)間如下：
TE 緩沖液中 Lysozyme 的終濃度 孵育時(shí)間
G 細(xì)菌 400 μg/ml 3-5 分鐘
-
G+ 細(xì)菌 3 mg/ml 5-10 分鐘
3. 加入350 μl裂解液RL（使用前請(qǐng)檢查是否加入β-巰基乙醇），渦旋震蕩混勻（此步驟可能出現(xiàn)不溶性沉淀），將溶液與沉淀全部加入到已裝入收集管（Collection Tube 2 ml）的過(guò)濾柱（Shredder Spin Column）中，10,000 rpm離心 2分鐘。
4. 向上步得到的濾液中加入250 μl無(wú)水乙醇，混勻（此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)沉淀）。將得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱（Spin Column RM）中（吸附柱已裝入2 ml收集管中），10,000 rpm離心1分鐘，棄掉廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
5. 向吸附柱中加入350 μl Buffer RW1，10,000 rpm離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
6. 配制DNase I 混合液：取52 μl RNase-Free Water，向其中加入8 μl 10×Reaction Buffer 和20 μl DNase I（1U/μl），混勻， 配制成終體積為80 μl的反應(yīng)液。
7. 向吸附柱中直接加入80 µl DNase I 混合液，20-30℃孵育15分鐘。
8. 向吸附柱中加入350 μl Buffer RW1，10,000 rpm離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
9. 向吸附柱中加入500 μl Buffer RW2（使用前檢查是否加入無(wú)水乙醇）, 10,000 rpm離心1分鐘,棄廢液。
10. 重復(fù)步驟9。
11. 將吸附柱放回收集管中，10,000 rpm離心2分鐘。
注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余乙醇去除，乙醇?xì)埩魰?huì)影響后續(xù)的酶促反應(yīng)(酶切、PCR等)。
12. 將吸附柱裝入新的RNase-Free的1.5 ml 收集管中，向吸附膜的中間加入30-50 μl RNase-Free Water，室溫放置1分鐘，10,000 rpm離心1分鐘，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。
注意：1） RNase-Free Water 體積不應(yīng)小于 30 μl，體積過(guò)小影響回收率。
2） 如果要提高RNA的產(chǎn)量，可用30-50 μl新的RNase-Free Water重復(fù)步驟12。
3） 如果要提高RNA濃度，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，重復(fù)步驟12。
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